Ang laro ay tumatagal ng lugar sa mga tropikal na resort ng Isle Delfino, na kung saan ay hugis ng isang dolphin at binubuo ng sampung pangunahing lokasyon. Ang isla ay higit sa lahat na nakatira sa pamamagitan ng mga karera Piantas at Nokis. Delfino Plaza ay capital Isle Delfino at pangunahing sentro ng laro. Mario nagtatakda para sa Isle Delfino para sa isang bakasyon sa Princess Peach, ang kanyang pang-oras tagapangasiwa Toadsworth, at ilang iba pang mga Toads, umaasa para sa isang nakakarelaks na bakasyon. Sa pagdating, makikita nila na ang isang beses-malinis island ay narumhan at nakapalitada sa graffiti. Bilang isang resulta ng mga ito ng polusyon, mga bagay na hugis sun-tinatawag na "Shine sprites", pinagkukunan ng isla ng kapangyarihan, may nawala, at ang mga isla ay sakop sa isang panghabang-buhay na anino. Ang salarin nakita pagkalat ng graffiti ay disguised bilang Mario (tinukoy bilang "Shadow Mario"). Mario ay agad na naaresto bilang siya dumating, maling inakusahan ng vandalizing isla. Siya ay ilagay sa pagsubok, napatunayang may kasalanan, at ipinag-utos na linisin ang mga graffiti at bawiin ang Shine sprites. Upang makatulong sa paglilinis, hahanap Mario Fludd, isang malakas na kanyon ng tubig na kung saan ay toted tulad ng isang backpack. Mario nagtatakda sa isang pakikipagsapalaran upang i-clear ang kanyang pangalan at hanapin ang mga tunay na kriminal, habang ibalik katahimikan at kaayusan sa Isle Delfino.
Mga Komento hindi natagpuan